APJ在血管生成和细胞增殖的病理生理中已被广泛描述。APJ过表达在许多疾病中的预后价值现已确立。本研究旨在设计一种特异性结合APJ的PET放射性示踪剂。合成了Apelin-F13A-NODAGA (AP747)，并用镓-68 ([68Ga]Ga-AP747)进行放射性标记。放射性标记纯度极好(> 95%)，稳定达2小时。[67Ga]Ga-AP747在过表达apj的结肠腺癌细胞上的亲和力常数在纳摩尔范围内。[68Ga]Ga-AP747对APJ的特异性分别通过体外放射自显像和体内小动物PET/CT对结肠腺癌小鼠模型和Matrigel塞小鼠模型进行了评价。[68Ga]Ga-AP747的PET/CT生物分布动态在健康小鼠和猪上实现了2小时，器官内信号的量化显示了适合PET成像的药代动力学特征，大部分通过尿路排泄。采用[68Ga]Ga-AP747和[68Ga]Ga-RGD2小动物PET/CT对Matrigel小鼠和后肢缺血小鼠进行21 d纵向随访。Matrigel中[68Ga]Ga-AP747的PET信号明显强于[68Ga]Ga-RGD2。激光多普勒观察缺血后肢血运重建情况。在后肢，[68Ga]Ga-AP747 PET信号在第7天比[68Ga]Ga-RGD2高2倍以上，在21天的随访中显著优于[68Ga]Ga-AP747 PET信号。第7天[68Ga]Ga-AP747 PET信号与第21天后肢后期灌注呈显著正相关。我们开发了一种新的PET示踪剂，可以特异性结合APJ， [68Ga]Ga-AP747，比临床上最先进的血管生成示踪剂[68Ga]Ga-RGD2显示出更有效的成像特性。

　　血管生成是一种适应性过程，允许已有的血管形成新的血管[1]。在病理生理条件下，如血管、肿瘤或炎症性疾病，血管生成可以上调或下调，这取决于环境相关因子表达的复杂平衡。因此，血管生成是缺血损伤期间和之后的保存、再生和功能恢复的相关治疗靶点[2]，或其抑制肿瘤增殖和播散的作用[3]。

　　考虑到个体间和个体内异质性的增加，在全身范围内进行组织血管生成监测对于指导和支持以血管生成为目标的治疗策略至关重要[4]。这种工具尚未在临床阶段得到验证。血管生成的非侵入性分子成像可能是一种有价值的方法，可以作为辅助工具，用于特定的促血管生成或抗血管生成治疗[1,5,6]。分子成像能够以最高的灵敏度评估分子靶点的表达[7,8,9,10,11,12,13]。自21世纪初以来，已经对血管生成成像的几个分子靶点进行了评估。血管生成的分子成像已经记录了许多分子靶点[14]，其中血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体(VEGF/VEGFRs)和αvβ3整合素研究最多[13,15]。靶向可溶性VEGF的放射性示踪剂，然后是VEGF受体或靶向精氨酸甘氨酸天冬氨酸(RGD)的基于整合素的显像剂，与它们在血管生成中的作用一致，已经得到了大量的评估，但尚未导致任何批准的分子成像探针，尽管在药代动力学、选择性和亲和力方面进行了许多优化[16,17,18,19]。最近的报道主要针对氨基肽酶(CD13)、金属蛋白酶和血管平滑素;然而，它们在临床阶段的特异性和兴趣仍有待评估[20,21,22]。由于缺乏临床更先进的放射性示踪剂，[68Ga]Ga-RGD及其变体通常被认为是血管生成分子成像的参考放射性示踪剂[23]。然而，经过20多年的发展，仍然没有相关的上市授权，可能是由于分子靶点的选择。

　　在这种情况下，我们确定了apelin/APJ系统作为血管生成成像的相关分子靶点，因为它与血管发芽形成有关[24,25]。APJ受体也被称为APLNR和AGTRL1，是a类g蛋白偶联受体。Apelin是该受体的内源性配体。Apelin/APJ系统被认为与不同的病理有关[26,27,28,29]。在血管形成的内皮细胞[30]和缺氧组织和肿瘤相关内皮的发芽血管中分别发现了高水平的APJ mRNA和蛋白[31,32]。最近，人们设计了几种APJ激动剂和拮抗剂[33]，调节APJ /APJ成为一种潜在的治疗方法[34,35,36]。因此，我们假设基于apelin-F13A对APJ的纳米摩尔亲和力，开发一种特异性靶向APJ的放射性示踪剂具有附加价值[33]。本研究旨在设计、开发和表征一种[68 Ga]Ga放射性标记的apelin- f13a(代号为[68 Ga]Ga- ap747)，以评估其作为血管生成PET成像和APJ表达量化的新型药物的价值。

　　1毫克apelin-F13A (Merck Millipore, Burlington, USA)加入10等量(14 mg) NODA-GA-NHS酯(CheMatech, Dijon, France)，溶解于700μL 0.2 mol/L的碳酸氢盐缓冲液中。然后将偶联物转移到tC18墨盒(Sep-Pak, Waters, Milford, USA)，然后用500μL hplc级无水乙醇(VWR, Radnor, USA)洗脱。在室温下蒸发溶剂，加入500μL hplc级水(VWR, Radnor, USA)。等分液(10μL)在- 20°C保存。

　　通过HRMS对AP747进行表征，使用配备电喷雾源的Waters SYNAPT G2 HDMS II(曼彻斯特，英国)，在正离子模式[ESI -(+)]下工作，以及四极杆/飞行时间分析仪(QTOF)。毛细管电压固定为2.8 kV，聚簇电位优化为30 V;溶解气体为N2，流量为100 L/h，温度为35℃。样品在掺1%甲酸的甲醇中稀释(1/100,v/v)，以10μL/min的流速注入ESI源。m/z值通过质量锁定程序使用带正电的醋酸钠簇的甲醇溶液进行校准。使用MassLynx 4.1 (Waters, Milford, USA)获取和处理实验数据。

　　在10μL AP747样品(1 μg/μL)或10μL NODAGA-RGD二聚体醋酸样品(1 μg/μL, ABX, Radeberg，德国)中加入50微升4 mol/L醋酸铵缓冲液(pH 7.4)。用0.1 mol/L的HCl从商用tio2基[68Ge]Ge/[68Ga]Ga发生器(Galliapharm, Eckert & Ziegler Berlin, Germany)中洗脱500μL [68Ga]GaCl3(200.6±40.9 MBq/500μL)，并加入反应器中。

　　混合物的最终pH为6.0。放射化学纯度(RCP)采用放射性薄层色谱法(radio-TLC)测定，采用miniGITA无线电薄层色谱扫描仪检测器(Elysia-Raytest, Straubenhardt，德国)，iTLC-SG板为固相(Agilent, Les Ulis，法国)，1 mol/L醋酸铵水溶液与甲醇1:1 (v/v)的混合物为流动相1(游离[68Ga]GaCl3 Rf=0;[68Ga]Ga-AP747 Rf=0.5;[68Ga]Ga-RGD2 Rf=1)和柠檬酸三钠0,1 mol/L pH=5作为流动相2 ([68Ga]Ga-AP747或[68Ga]Ga-RGD2 Rf=0);free [68Ga]GaCl3 Rf=1)。放射化学纯度也通过无线电高压液相色谱(radio-HPLC)测定，使用Ultimate 3000泵(Dionex, ThermoFisher, Waltham，美国)，使用反相c18柱(Luna LC柱150 × 4.6 mm, Phenomenex, Torrance，美国)，在线放射性检测器(Gabi, Elysia-Raytest, Straubenhardt，水/乙腈与0.1%三氟乙酸(TFA)的梯度从100/0 (v/v)到0/100 (v/v)，流速为2.5 mL/min(游离[68 Ga]GaCl3保留时间:1.0 min;[68Ga]Ga-RGD2滞留时间=3.5 min;[68Ga]Ga-AP747保持时间:4.0 min)。使用Chromeleon软件(ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)解释放射性高效液相色谱图。在400μL生理盐水或400μL人血清中培养100μL放射性示踪剂后，按照前面的描述[37]对[68Ga]Ga-AP747的放射化学稳定性进行评估。在室温和37℃下，在放射合成后60和120分钟用放射性薄层色谱检查放射化学纯度。

　　从[67Ga]Ga-citrate (200mbq, Curium, Paris, France)中得到镓-67，并使用两个Light silica Sep-Pak (Waters, Milford, USA)将镓-67转化为[67Ga]GaCl3。简单地说，将[67Ga] ga -柠檬酸盐在墨盒上充电，然后用1ml 0.1 mol/L HCl (KT720P, Rotem Industries, Dimona, Isra?l)以[67Ga]GaCl3的形式洗脱，随后用于放射性标记。最终产品用3ml磷酸盐缓冲盐水配制(PBS, Eurobio-scientific, Les Ulis, France)。将该溶液加入AP747 (1 μg/μL)中。RCP采用放射性薄层色谱法测定，固相为iTLC-SG板(Agilent, Les Ulis, France)，流动相为柠檬酸三钠0.1 mol/L ([67Ga]Ga-AP747 Rf=0， [67Ga]GaCl3 Rf≥0.8，[67Ga]Ga-NODAGA Rf≥0.8)。

　　logD值的测定采用摇瓶法[38]。简单地说，将50μL的[67Ga]Ga-AP747加入到1 mL辛醇和生理血清(1:1)的溶液中。将该溶液搅拌并旋转2分钟，然后离心(100 g, 5分钟)。每相收集3个100μL样品，使用伽马计数器(Wizard 2480, perkins - elmer, Waltham, USA)测量各自的活性。

　　人结肠腺癌T84细胞系(RRID:CVCL_0555)在过滤过的DMEM-F12 (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)/Glutamax (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)培养基中培养。人脐静脉内皮细胞(HUVECs，感谢来自La Conception University Hospital细胞治疗实验室，AP-HM, Marseille, France)在过滤的内皮细胞生长培养基MV (EGM-2 supplements mix, Promocell, Heidelberg, Germany)中培养。两种培养基均添加10%的废胎牛血清和1%的抗生素-抗真菌混合物(青霉素-链霉素)。细胞系在37°C的5% CO2加湿培养箱中保持。用肿瘤坏死因子α (tnf - α， 10 ng/mL, Euromedex, Souffelweyersheim，法国)孵育过夜获得HUVECs活化。

　　Western Blot检测APJ的表达。在tnf激活或基线(PBS)条件下，将人结肠腺癌T84细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞裂解液装在聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE, 4-12%， Invitrogen, Waltham, USA)上。迁移后，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并通过Rouge-Ponceau进行检测。膜饱和[tris缓冲盐水Tween 20% (TBST);牛血清白蛋白(BSA) 3%]，然后加入抗apj抗体(1μg/mL, 5H5L9, rabbit monoclonal Invitrogen, Waltham, USA)，在4°C搅拌过夜。三次TBST洗涤后，加入山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记的二级抗体(1/2000，#31460,ThermoFisher, Waltham, USA) 1小时。使用增强型化学发光(ECL)试剂盒(#32106,ThermoFisher, Waltham, USA)在室温下孵育5分钟获得启示。通过Gbox系统(Syngene, Cambridge, UK)实现膜图像采集，曝光时间为1分钟。经过10分钟的剥离和三次洗涤，膜被饱和[tris缓冲盐水Tween 20% (TBST);牛血清白蛋白(BSA) 3%)，与GADPH抗体[#2118，(14C10)兔单克隆，Cell Signaling Technologies, USA]在4°C搅拌下孵育过夜，作为抗apj抗体。三次TBST洗涤后，加入山羊抗兔hrp标记的二级抗体(1/2000，#31460,ThermoFisher, Waltham, USA)半小时。曝光时间30 s，按上述方法完成曝光和膜图像采集。使用特定软件(GeneTools, Syngene, Cambridge, UK)测量每个波段的光密度。通过分割GAPDH表达作为蛋白负荷控制，对APJ表达进行归一化评价。

　　将T84细胞以每孔250.103个细胞的密度接种于24孔板(康宁，康宁，美国)，用完全培养液孵育过夜。实验开始前30分钟，将盘子放在冰上。然后将[67Ga]Ga-AP747以0.1、1、10、100或250 nmol/L的浓度加入培养基中，在4°C下孵育2小时，一组4次(n=3)。去除培养基，并用冰冷的PBS (Eurobio-scientific, Les Ulis, France)洗涤细胞两次，停止孵育。最后，用1 mol/L NaOH处理细胞，用伽马计数器(Wizard 2480, perkins - elmer Waltham, USA)测量活性。为了评估非特异性亲和力，在选定的孔中加入过量的非放射性apelin-F13A(终浓度为1μmol/L)。

　　将T84细胞以每孔1.106个细胞的密度接种于24孔板(康宁，康宁，美国)，用完全培养液孵育过夜。每孔加入[68Ga]Ga-AP747 (1.7 MBq/10μL)。在6个孔中，在与[68Ga]Ga-AP747孵育前10分钟，在T84细胞中加入大量(500μg/500μL) apelin-F13A (Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, USA)(3个重复，n=6)。孵育1小时后，取出培养基，用PBS (Eurobio-scientific, Les Ulis, France)洗涤细胞3次，并评估其活力。利用基于磷的Cyclone自射线照相仪(perkins - elmer, Waltham, USA)对井进行了[68Ga]Ga-AP747信号的自射线照相测量。在没有细胞的孔中，通过[68Ga]Ga-AP747活性测量背景信号。

　　所有涉及动物的程序均由研究所动物护理和使用委员会(CE71，艾克斯-马赛大学，项目#15790，#32157，#31843)批准，根据2010/63/EU欧盟指令和reach指南2.0进行[39]。小鼠被安置在强化的笼子里，并被放置在温度和湿度控制的房间里，每天进行监测，给它们喂食水和随意的商业饮食。猪被饲养在强化箱中，每天进行监测，提供随意取水和适应其营养需求的商业日粮。

　　9周龄雄性瑞士小鼠(Janvier Labs, n=3)尾侧静脉注射[68Ga]Ga-AP747(4.45±0.32 MBq/70μL)，注射后连续获取小动物PET图像，直至注射后2 h。器官内量化的PET信号以衰减校正注射剂量(%ID)的平均值±SD百分比表示。在医用空气麻醉下，在2%异氟醚条件下，在nanscan PET/CT相机(Mediso, Budapest, Hungary)上采集小动物动态PET/CT图像120 min [PET参数:迭代次数:4，重合:1-3，视场(FOV): 10 cm]。CT参数固定在35 kV电压下，300 ms曝光，中等变焦，在与PET相同视场下采用半圆法获取。使用Nucline软件(Mediso，布达佩斯，匈牙利)在以下时间框架内进行CT衰减校正重建:0-5分钟，6-10分钟，11-15分钟，16-20分钟，21-25分钟，26-30分钟，31-45分钟，46-60分钟，61-75分钟，76-90分钟，91-105分钟和106-120分钟。使用VivoQuant软件(v.3.5, InVicro, Boston, USA)对衰减和衰减校正的PET图像进行基于CT的定量兴趣体积(VOI)分析。

　　3只9周龄瑞士雄性小鼠尾侧静脉注射[68Ga]Ga-AP747(4.02±0.16 MBq/70μL)，异氟醚麻醉(2%)维持2小时。在注射后2、5、10、15、20、30、45、60、75、90、105和120分钟采血，并进行伽马计数和衰减校正。用非线性回归估计等离子体半衰期(t1/2)。注射后2小时，对小鼠实施安乐死，收集主要器官(心、肝、肺、肌肉、脑、脾、肠、骨、胰腺和肾脏)，PBS洗涤，称重，计数。结果经过衰减校正，并以器官重量校正后的注射剂量百分比(%ID/g)表示。

　　6月龄Pietrain猪(n=3，产自Blossin, Aubagne, France)在2%七氟醚的空气麻醉下注射[68Ga]Ga-AP747(85±30 MBq/5 mL, 0.9% NaCl)。在注射[68Ga]Ga-AP747后15分钟开始进行一系列6次15分钟长的静态PET/CT采集(Discovery PET/CT 710, GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA)，并在注射后45分钟、75分钟、90分钟、105分钟和120分钟重复(PET参数:迭代次数:4，重合:1-1，视场:50 cm，重建类型:VPHD;CT参数:120kv, 220ma，切片厚度:3,75 mm，图片数:47，检测器宽度:40 mm)。使用ADW软件v4.6 (GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA)重建衰减校正后的图像，并使用VivoQuant软件v.3.5 (InVicro, Boston, MA, USA)对基于ct的人工绘制感兴趣体积(voi)进行PET信号量化。结果经过衰减校正，并以注射剂量的平均±sd百分比(%ID)表示。

　　在2%异氟醚麻醉下，向6周龄雄性瑞士裸鼠(Charles River, Saint-Germain-Nuelles, France, n=3)皮下注射1.106个T84细胞(100μL, PBS)，建立人大肠腺癌异种移植物。

　　在2%异氟醚麻醉下，向9周龄雄性瑞士小鼠(Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France, n=12)皮下注射300μL Matrigel (Dutscher, Bernolsheim, France)，添加10%胎牛血清，建立Matrigel塞。7只Matrigel小鼠进行了小动物PET随访，另外5只小鼠进行了体内特异性研究，如下所述。

　　将异位结肠腺癌移植瘤(n=3,1370±167.3 mm3)或Matrigel塞(n=5,635±146 mm3)小鼠尾侧静脉注射[68Ga]Ga-AP747(5.14±0.60 MBq/80μL)，每隔1小时进行小动物PET成像，然后进行CT扫描。小动物PET成像采集持续20 min(迭代次数4次，重合1-3次)，视场(FOV)为10 cm。CT参数固定在35 kV电压下，300 ms曝光，中等变焦，在与PET相同视场下采用半圆法获取。使用Nucline软件(Mediso, Budapest, Hungary)进行CT衰减校正重建。第二天，小鼠在静脉注射5.5±0.20 MBq/80μL [68Ga]Ga-AP747前30分钟静脉注射100倍过量的非偶联肽(apelin-F13A, 100μg/100μL)。注射[68Ga]Ga-AP747后1 h获得PET图像。组织摄取值表示为目标与背景PET信号比的平均值(TBRmean)，背景以左侧腓肠肌为代表。

　　如前所述，在2%异氟醚麻醉下，对9周龄雌性瑞士小鼠(Janvier Labs, n=8)行股动脉切除术后诱导单侧后肢缺血(HLI)[40]。激光多普勒灌注成像(Perimed, Craponne, France)用于评估术后第0天至第21天的血运重建情况。灌注测量以手术当日后肢缺血与对侧血流的比值表示。

　　分别于缺血后第1、3、7、10、13、21天在尾侧静脉注射[68Ga]Ga-AP747(5.66±0.57 MBq)和11 h后注射[68Ga]Ga-RGD2(5.96±0.95 MBq)(图1)。静脉注射[68Ga]Ga-AP747或[68Ga]Ga-RGD2 1 h后获取静态PET图像，并进行CT扫描。小动物PET成像采集持续20 min(迭代次数4次，重合1-3次)，视场(FOV)为10 cm。CT参数固定在35 kV电压下，300 ms曝光，中等变焦，在与PET相同视场下采用半圆法获取。使用Nucline软件(Mediso, Budapest, Hungary)进行CT衰减校正重建。组织摄取值以靶-背景(基质-肌肉)或缺血-对侧后肢PET信号比表示。

　　图1

　　

　　使用[68Ga]Ga-AP747 PET与[68Ga]Ga-RGD2 PET在Matrigel和HLI小鼠模型上进行体内纵向比较研究

　　HLI小鼠颈椎脱位后，轻剥后肢皮肤，剪断肌腱。分离左(对侧)和右(缺血)腓肠肌，用异戊烷和液氮在OCT中快速冷冻，用低温恒温器制作10μm切片，保存在?80℃。切片在低温甲醇(- 20°C)中RT孵育5分钟，PBS洗涤3次，在含有10%胎牛血清和3%牛血清蛋白的PBS中孵育1小时。一抗apj抗体(兔单克隆5H5L9, 2μg/mL in PBS and 3% BSA, Invitrogen, Waltham, USA)在4°C黑暗湿室中孵育过夜。然后进行5次PBS洗涤，在暗湿室中加入第二抗山羊兔抗体(Alexa flu488, 1/500 PBS和3% BSA, ThermoFisher, Waltham, USA) 1小时。最后在黑暗中用PBS +/+洗涤三次载玻片。在组织学切片上加入固定培养基(Fluoromount, Invitrogen, Waltham, USA)。在4°C下干燥过夜后，使用NIE显微镜(Nikon, Tokyo, Japan)观察载玻片，并使用NIS Elements Imaging软件(Nikon, Tokyo, Japan)进行分析。

　　采用Prism v9 (GraphPad, San Diego, USA)软件进行统计学分析，P≤0.05为有统计学意义。在用Shapiro-Wilk检验检查数据是否为正态分布后，将放射自显影结果提交给非配对t检验。[68Ga]Ga-AP747 PET信号的体内特异性用Shapiro-Wilk检验检验数据分布正态性后，提交配对t检验。HLI小鼠模型灌注定量数据的比较采用单因素方差分析和事后多重比较检验。体内纵向研究的PET量化数据采用双向方差分析和Sidak多重比较事后检验进行比较。使用Pearson R相关检验检验相关性。

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