哈佛大学的一组研究人员最近扩大了低温电子显微镜(cryo-EM)的使用范围，以高分辨率分析小蛋白质。在他们发表在预印本服务器bioRxiv*上的研究中，研究人员描述了一种方法，该方法可以通过单颗粒冷冻电镜(cryo-EM)来确定小蛋白质的高分辨率结构，该方法使用了一种称为Legobody的靶向结合纳米体集合。

　　这篇新闻文章是对一份在发表时没有经过同行评议的初步科学报告的评论。自首次发表以来，该科学报告现已经过同行评审，并被接受在《科学杂志》上发表。初步报告和同行评议报告的链接可在本文底部的来源部分找到。观点来源

　　单粒子电子低温电镜是测定小分子蛋白质结构的理想技术。尽管冷冻电镜技术很实用，但它在分析小于100千道尔顿(kDa)的粒子方面的能力有限。这对小于100 kDa的蛋白质的分析提出了挑战，因为大约50%的膜和其他医学上重要的蛋白质小于50 kDa。

　　在使用冷冻电镜成像小蛋白质的几种不同方法中，一种方法涉及将目标蛋白质与不同的支架融合或使用结合伙伴来增加蛋白质的大小。用于此目的的一些不同的支架包括修饰的锚蛋白重复序列蛋白(DARPins)、抗体的Fab片段或纳米体。

　　纳米体来源于骆驼的单链抗体，是融合方法的一个有吸引力的选择。重要的是，纳米体可以形成刚性结构，与不同形状的靶蛋白结合，如环、凸面和空腔。

　　此外，这些支架可以从免疫的骆驼类或噬菌体、酵母细胞或核糖体显示的大型体外文库中选择。

　　纳米体也可以快速大量生产。这种方法的其他优点包括它们将蛋白质锁定在固定构象中的能力，以及它们在x射线结构分析中的广泛应用。

　　尽管有这些优点，纳米体的尺寸小，在12到15 kDa之间，是其直接用于低温电子显微镜的限制因素。为了克服这个问题，目前研究的研究人员通过将两个刚性支架附着在这个结合伙伴上，将纳米体的大小增加到大约120 kDa。

　　在他们的工作中，研究人员首先确定了两种小蛋白质的结构，其中包括KDEL受体(KDELR)，其大小约为23 kDa。第二个蛋白是SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域(RBD)，约为22 kDa。这两种蛋白质都是不对称单体，小于40 kDa，远低于直接低温电镜单颗粒分析的估计极限。

　　KDELR是一种小而非对称的蛋白质，在膜外没有结构域，在样品制备过程中聚集的倾向很高。在目前的研究中，研究人员使用补充“技巧”来减少聚集，增强稳定性，并确保首选的颗粒取向。KDELR是膜蛋白的代表，许多膜蛋白在药物开发中有很大的兴趣。

　　同样，SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD也给低温电镜分析带来了类似的挑战，因为它由b链和延伸的多肽片段组成。除了体积小之外，与主要由a-螺旋组成的蛋白质相比，这些特征使RBD成为一个更困难的模型。

　　在这里，研究人员获得了一个高质量的地图，特别是在RBD/纳米体界面，所有相互作用的氨基酸的侧链密度。

　　研究人员展示了3.2?和3.6 ?的总分辨率，其密度足以为KDELR和SARS-CoV-2 RBD地图重新构建模型。这些分辨率证实了两种支架和纳米体之间的相互作用。

　　除了这两种支架外，还有针对纳米体的抗体fab片段和与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的纳米体结合蛋白a片段。fab结合结构域也被整合到Legobody中。这些结构之间的所有相互作用都是刚性的，保持了leggobody的独特形状。

　　为此，leggobody由两个支架组成的两个侧臂以及由纳米体贡献的中心叶组成。综合起来，leggobody的总大小约为120 kDa。此外，纳米体位置的对准中心有助于低温电镜分析的所有步骤，从颗粒挑选和分类到最终的细化。

　　两种纳米体相互作用支架的产生。a.将纳米体Nb_0与Fab_8D3混合，并进行凝胶过滤。用SDS-PAGE和考马斯蓝染色对各组分进行分析。b, Nb_0/Fab_8D3配合物的晶体结构用卡通表示。Nb_0为黄色，Fab_8D3为蓝色。c，纳米体图，β链按惯例标记。CDR回路用红色表示，与Fab相互作用的区域用蓝色表示。d，纳米体(Nb)相互作用图;黄色)与蛋白A的结构域C (PrAC;橙色)嫁接到麦芽糖结合蛋白(MBP;紫色)。Nb和MBP_PrAC之间的相互作用区域用橙色表示，中间用虚线隔开。e，将PrAC通过柔性连接器(MBP_L_PrAC)与MBP融合或接枝到MBP (MBP_PrAC)上，与Nb混合。混合物与mbp相互作用的直链淀粉树脂孵育，结合材料进行SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析。输入对应于用于下拉的材料的50%。

　　总的来说，这里讨论的Legobody方法是一种足够的方法，允许冷冻电镜用于小蛋白质的结构测定。研究人员指出，这种新方法可以用于任何与可用纳米体紧密结合的目标结合。

　　值得注意的是，当前方法存在一些局限性。此外，将来修改Legobody以增加其分子质量、稳定性和刚性以最终提高冷冻电镜图的分辨率可能很重要。

　　这篇新闻文章是对一份在发表时没有经过同行评议的初步科学报告的评论。自首次发表以来，该科学报告现已经过同行评审，并被接受在《科学杂志》上发表。初步报告和同行评议报告的链接可在本文底部的来源部分找到。观点来源

　　2023年4月12日-预印本初步研究论文，这篇文章是ba在同行评议的《科学杂志》上发表。这篇文章经过相应的编辑，加入了一个链接到最终的同行评审论文，现在显示在来源部分。